Payload电荷比疏水性更重要？颠覆ADC稳定性认知的最新发现

 

“反例”实验

 
研究团队采用了一种高度平行的策略，构建了两种模型ADC，如图1。两者唯一的区别在于载荷的末端基团：

  • ADC-vcMMAE：载荷为中性且疏水的单甲基澳瑞他汀E（MMAE），其logD在pH 5-7时保持恒定（4.1）。

  • ADC-vcMMAF：载荷为带负电的单甲基澳瑞他汀F（MMAF），其logD从pH 5时的3.2降至pH 7时的0.8，疏水性显著降低。

两种ADC均使用同一批还原的IgG1单克隆抗体（mAb），通过链间半胱氨酸-马来酰亚胺化学偶联，采用相同的mc-val-cit-PAB连接子，最终获得平均药物-抗体比（DAR）为4的ADC，排除了连接子和DAR的影响

图1. ADC-vcMMAE/MMAF 分子结构图

 

分析技术

 

  • 疏水性分析：通过疏水相互作用色谱评估整体疏水性差异。

  • 电荷分析：采用成像毛细管等电聚焦（icIEF）和毛细管区带电泳（CZE）测定等电点及电荷异质性。

  • 胶体相互作用：通过静态光散射测定表观第二维里系数A₂，计算硬球校正后的A₂/B₂₂值，评估分子的自相互作用倾向。

  • 聚集倾向评估：在界面应力（摇晃，2400 rpm，24小时）和热应力（40°C，2周）条件下，使用尺寸排阻色谱（SEC）和浊度法（OD₃₅₀）监测单体损失和高分子量物种（HMWS）的形成。

  • 表面活性分析：通过表面压力/张力测量，评估ADC在空气-水界面的吸附行为，并采用二阶多项式拟合计算初始表面压力增加率（dP/dt_init）。

  • 静电势能计算：使用APBS软件对模型IgG1抗体（PDB 1HZH）进行静电表面势能模拟，以解释电荷变化的影响。

 

 

测试数据

 

（1）疏水性与电荷特性

  • 疏水性：HIC分析（图2）显示，ADC-vcMMAF的疏水性显著低于ADC-vcMMAE，与logD数据一致（vcMMAF在pH 7时logD=0.8，而vcMMAE为4.1）。

图2. 使用HIC对ADC-vcMMAE和ADC-vcMMAF进行疏水性分析

 

 

 

  • 电荷特性：icIEF分析（图3）表明，母体mAb的等电点（pI）分布较窄（8.9-9.3，主峰9.16）。ADC-vcMMAE的电荷谱与mAb相似，仅出现一个小肩峰。而ADC-vcMMAF的电荷谱发生明显的酸性偏移，pI范围更宽（8.3-9.2），表明其净电荷降低，电荷异质性增加。
     

图3. mAb和ADC在IcIEF 上分析的pI分布

 

 

（2）胶体相互作用

  • 两种ADC的A₂/B₂₂值均显著低于母体mAb，表明偶联载荷后，分子的排斥性相互作用减弱。

表1. mAb和ADC的A₂和A₂/B₂₂值

  • 与ADC-vcMMAE相比，ADC-vcMMAF的A₂/B₂₂值更低，胶体稳定性更差，显示其净静电排斥作用更弱。

  • 静电势能计算表明，在模拟DAR 4型酸性载荷的IgG1模型中，铰链区形成显著的负电势，这与天然抗体的正电势相反，可能引入了新的局部吸引相互作用。

 

 

（3）聚集行为

  • 界面应力（摇晃）：

稳定性排序为：ADC-vcMMAF < ADC-vcMMAE < mAb。
摇晃24小时后，ADC-vcMMAF的聚集程度最高，在pH 7时单体含量显著下降，并形成不溶性聚集体（浊度增加239 mAU）。相比之下，ADC-vcMMAE在pH 7时仍主要生成可溶性HMWS（49%）。未振荡对照在各pH下单体含量均>95.8%。

  • 热应力（40°C）：稳定性排序与界面应力一致。母体mAb在pH 5-7范围内单体含量稳定，而两种ADC在所有pH下均发生显著单体损失（p<0.05）。

  • pH效应：随着pH升高（从5到7），所有分子的聚集倾向增强，且ADC-vcMMAF的聚集差异增大。在pH 9时，接近mAb的等电点，所有分子均出现严重的单体损失和HMWS。

图4.振荡应力（左）和热应力（右图）对mAb和ADC聚集的影响。

 

 

（4）表面活性

表2. 表面压力 (P30分钟) 和初始表面压力增加率 (dP/dtinit)

 

  • 表面压力测量显示，在pH 7时，所有分子的表面压力均高于pH 5（p<0.05），表明pH升高后分子更易吸附到界面。

  • 尽管ADC-vcMMAF的疏水性最低，但其表面压力增加速率（dP/dt_init）和30分钟准平衡表面压力（P30min）均高于疏水性更强的ADC-vcMMAE，表明其表面活性更强。该趋势与电荷变化一致：ADC-vcMMAF因净电荷最低，静电排斥能垒最小，更易吸附到界面。

 

 

 

结论

 
通过一系列稳定性实验和高级分析技术结论如下：
1. 载荷电荷是影响ADC稳定性的独立因素：带负电的vcMMAF载荷（尽管疏水性较低）比中性但更疏水的vcMMAE载荷，更严重地破坏了ADC的稳定性，导致更高的聚集倾向。
2. 电荷通过双重机制影响稳定性：

  • 降低静电排斥：引入负电荷降低了ADC的整体净电荷，减弱了分子间的静电排斥力，破坏了胶体稳定性。

  • 增强表面活性：净电荷的减少降低了蛋白质吸附到空气-水界面的能垒，使ADC更易在界面应力下发生展开和聚集。

3. “正电荷损失”与“负电荷增加”效应相似：无论是通过赖氨酸偶联损失正电荷，还是通过链间半胱氨酸偶联引入负电荷，最终都会导致净电荷降低，从而产生相似的失稳效应。

 

 

 

 

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